粮油食品中黄曲霉毒素检测方法综述李书国，陈辉，李雪梅，任媛媛(河北科技大学食品科学系，河北石家庄050018)摘要：简要介绍了黄曲霉毒素的分子结构、理化性质、对人体健康的危害及食品污染情况和限量标准，综述了目前粮油食品中黄曲霉毒素分析检测方法的现状、特点及存在问题，指出了黄曲霉毒素分析测定方法的发展方向。关键词：粮油食品；黄曲霉毒素；食品分析；免疫分析；生物传感器中图分类号：TS297．4文献标识码：A文章编号：1(I)7—7561(2009)呓一0362—04Sunmmry of the methods detecting aflatoxin in oe删and oil foodLIShu—guo，CHENHni，UXue—mei，RENYuan-yuan(Department ofFoodScience，HebeiUniversity ofScience andTechnology，ShijiazhuangHebei050918)A136tragt：This article briefly introduced chemical structure of aflatoxin，its physical and chemical properties，hazard to hutmn health，the status of contamination and its limit standard in food．Various analytical methodswere systemat— ically expounded about the status，advantage and disadvantage．The development direction of the methods for deter— mining aflatoxins were pointed out．Key words：cereal and oil food；aflatoxin；food analysis；inmaunoassay；bioseusor黄曲霉毒素是黄曲霉(Asper西nus flavus)和寄生曲霉(A．parasitieus)等的代谢产物，主要存在于霉变的花生、谷物、果仁和大米等食物中，食用油等制品中也经常发现黄曲霉毒素；1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为天然存在的一类致癌物，是一种毒睦极强的剧毒物质…1，因此分析测定食品中黄曲霉毒素的含量水平对保障食品质量安全具有极其重要的意义。1黄曲霉毒素的分子结构及理化性质黄曲霉毒素(Aflatoxins)，是由黄曲霉和寄生曲霉代谢产生的一组化学结构类似、致毒基团相同的化合物，目前已分离鉴定出18种，主要是黄曲霉毒素B】、B2、Gl、G2以及由B1和赐在体内经过羟化而衍生成的代谢产物M】、M2等，B，为毒性及致癌性最强的物质。黄曲霉毒素的的基本结构为二呋喃环和香豆素。B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)，前者为基本毒性结构，后者与致癌有关。M。是黄曲霉毒素B】在体内经过羟化而衍生成的代谢产物，其中M】和M2主要存在于牛奶中u。2]。在紫外线下，黄曲霉毒素B，、眈发蓝色荧光，黄曲霉毒素G1、G2发绿色荧光。黄曲霉毒素的相对分子量为312～346，在水中的溶解范围为10～加mg／L，易溶于油，可大量溶解于氯仿、甲醇、乙腈、二甲基亚砜等中等极性的有机溶剂中，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有分解，在pH9～10的碱性溶液中分解迅速，收稿日期：2008—06—30作者简介：李书国(1969一)，男，河北景县人，副教授同时易被强氧化剂分解。其纯品为无色结晶，耐高温，黄曲霉毒素B，的分解温度为268℃，紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性。2黄曲霉毒素的主要危害黄曲霉毒素对人类健康的危害主要是由于人们食用被黄曲霉毒素污染的食物，途径有二，其一是由受黄曲霉毒素(主要为B，)污染的植物性食物摄入，其二是经饲料而进入奶或乳制品(包括乳酪、奶粉等)的黄曲霉毒素(主要为M，)。黄曲霉毒素B，的半数致死量为0．36 mg／kg体重，属特剧毒的毒物范围(动物半数致死量10 nv,／kg，它的毒性比氰化钾大10倍，比砒霜大68倍)，它引起人的中毒主要是损害肝脏，发生肝炎、肝硬化、肝坏死等。临床表现有胃部不适，食欲减退，恶心，呕吐，腹胀及肝区触痛等；严重者出现水肿，昏迷，以致抽搐而死。黄曲霉毒素是目前发现的最强的致癌物质，其致癌力是奶油黄的900倍，比二甲基亚硝胺诱发肝癌的能力大75倍，比3，4．苯并芘大4000倍，它主要诱使动物发生肝癌，也能诱发胃癌、。肾癌、直肠癌及乳腺、卵巢、小肠等部位的癌症。亚洲和非洲的疾病研究机构的研究工作表明：食物中黄曲霉毒素与肝细胞癌变(LiverCellCancer，LCc)呈正相关性，长时问食用含低浓度黄曲霉毒素的食物被认为是导致肝癌、胃癌、肠癌等疾病的主要原因。中国医科院肿瘤医院明利华教授课题组首次确定了黄曲霉毒素使乙肝患者患肝癌的累积暴露剂量为0．13～0．49 mg／kg体重，这仅为在实验条件下，给无乙肝感染的恒河猴喂食黄曲霉素使之致肝癌所需累积剂量的1／700，确立黄曲霉素是常见肿瘤——肝细胞癌的重囵粮油食品科技第17卷2009年第2期质量控制要的辅助病因。1988年国际肿瘤研究机构(Interna． tionalAgency forResearch onCancer，IARC)将黄曲霉毒素B，列为人类致癌物。除此以外，黄曲霉毒素与其他致病因素(如肝炎病毒)等对人类疾病的诱发具有叠加效应11，3“j。黄曲霉毒素对人和动物健康的危害均与黄曲霉毒素抑制蛋白质的合成有关，黄曲霉毒素分子中的双呋喃环结构是产生毒性的重要结构，研究表明黄曲霉毒素的细胞毒作用可干扰信息RNA和DNA的合成，进而干扰细胞蛋白质的合成，导致动物全身性损害。3黄曲霉毒素的污染现状及食物中的限量标准据调查发现，霉菌影响世界上40％的食品作物，并在代谢过程中产生毒素。联合国粮农组织估计全世界谷物供应的25％受霉菌毒素污染。据报道全世界每年至少有2％的农作物因污染黄曲霉毒素而报废。王君等怛J分析了取自重庆、福建、广东、广西、湖北、江苏、上海、浙江等地区市售的玉米、花生、大米、核桃、松子等284份样品黄曲霉毒素的污染情况，结果表明，玉米中黄曲霉毒素的检出率为70．27％，平均含量为36．51肛∥k，最高为1098．36弘g／蝇，并有14．86％的玉米样品中黄曲霉毒素B】含量超出国家限量标准。花生中黄曲霉毒素的检出率为24．24％，平均含量为80．27 bLg／kg，最高为437．09 t-g／kg，且有3．03％的花生样品中黄曲霉毒素含量超出国家及国际食品法典限量标准。大米、核桃、松子的污染情况较轻，全部符合国家限量标准。何建忠等[3J对2000年至2004年问广西贵港市生产加工的花生油抽取样品459份进行黄曲霉毒素B，检测，黄曲霉毒素B1检出率分别为：2．9％，32．3％，16．9％，1．5％，0，超标率分别为：0，18．8％，9．6％，0，0，其中2001年和2002年花生油的黄曲霉毒素检出率和超标率较高，主要原因是当地这两年在花生收获季节碰到了雨水天气，容易导致花生发芽、发霉，此外加工油坊没有认真地对霉变、腐烂的花生米进行筛选，制油工艺中没有除黄曲霉毒素工序。黄曲霉毒素危害性大，存在范围广，为了预防黄曲霉毒素中毒事件的发生，维护人类健康，世界上已有70多个国家和地区对食品中黄曲霉毒素的含量作了严格限量要求。美国联邦政府有关法律规定，人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒素含量(指B】+B2+G1+G2的总量)不能超过20弘g／kg，人类消费的牛奶中M，的含量不能超过0．5／且g／kg，其他动物饲料中的含量不能超过300 t,g／kg。欧盟于1999年1月1日开始执行的ECNo．1525／98法规规定，直接提供给人类食用的食物及组成食品的组分中黄曲霉毒素B，的含量不能超过2 bLg／kg，黄曲霉毒素B】、B2、G1、G2的总量不得超过4／zg／kg。日本规定，食品中黄曲霉毒素B，的含量不能超过10肛∥kg。根据我国国家标准GB2761--2005((食品中真菌毒素限量》的规定，我国食品中黄曲霉毒素B，允许量标准为：玉米、花生仁、花生油中不得超过20“g／kg；玉米及花生仁制品(按原料折算)中不得超过20弘昏／kg；大米、其他食用油中不得超过10弘∥kg，其他粮食、豆类、发酵食品中不得超过5弘g／kg；婴儿代乳食品中不得检出；牛乳及其制品中黄曲霉毒素M，限量卫生标准规定，不得超过0．5肛g／kgHJ。4食用油中黄曲霉毒素的分析检测方法目前检测黄曲霉毒素的方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、以酶联免疫为基础的免疫分析、免疫亲和分析法如微孔板酶联免疫吸附分析法(ELISA)以及生物传感器法等。4．1薄层色谱法(TLC)TLC法是传统的检测AFB，最常用方法，是应用最早、最广的分离、分析技术，曾是我国测定食品及饲料中AFB．的国家标准方法之一，其原理是：样品经提取、浓缩、薄层分离后，在365 nn3波长的紫外光照射下，黄曲霉毒素B1、B2产生紫色荧光，G，、G2产生绿色荧光，然后根据其在薄层板上显示的荧光的最低检出量来定量。其优点是：所用的试剂、设备简单，费用低廉，容易掌握，适用大量样品的分离、筛选，一般的实验室均可开展，属于定性和半定量的功能。为了提高薄层层析法的精度，还建立薄层扫描等其他的方法来确定黄曲霉毒素，它是薄层层析法的仪器化，样品的处理和层析条件与薄层层析法相同，只是在标准品的设定和结果判定上有所不同。如卢艳杰等介绍了一种简单、微型、低功率的光度检测器用于定量薄层板上的AFT，该装置简单、便宜可代替薄层扫描仪等其他测定AFT含量的设备，最低检测限可达1 ng，符合欧洲对AFr规定的限量。卢艳杰等介绍了过压薄层色谱法(O眦)结合光度计，成功地对多种食品中的黄曲霉毒素B，、B2、G，和G2进行测定，同时该方法还适用于样品的提纯和分离，一次可对十个样品进行分析，做到快速、有效、低耗地定量食品中的AFTL5j。该法的局限性与不足之处在于薄层色谱法检测AFT的操作步骤多，样品前处理烦琐，并且提取和净化效果不够理想，提取液中杂质较多，因而在展开时影响斑点的荧光度，导致灵敏度下降。灵敏度低、重现差、操作烦琐、时间长且安全性差等缺点，已越来越不适用现代分析的要求。4．2高效液相色谱法(HPLC)高效液相色谱法具有高效、快速、准确性好、灵敏度高、重现性好、检测限低、定量准确的特点，可同时分离多种黄曲霉毒素，操作简便，适于大批量样品的分析。倪梅林等…6以C18柱为固定相，以水+异丙醇+乙腈(80+12+8)为流动相，用荧光检测器圆质量控制粮油食品科技第17卷2009年第2期进行检测，其激发波长365Bin，发射波长450 nnl，样品用甲醇和水混合液进行萃取，随后进行衍生化处理，处理后溶解于流动相，进行液相色谱测定。该法的最低检出限为1．0 p．g／kg。对浓度为25肚g／mL($Et当于样品5．0_ug／kg)的样液进行10次检测，测定精密度分别为：G1，11．84％，B1，4．28％，G2，13．41％，B2，14．20％。李培武等介绍了利用c18键合硅石作为基质固相分散提取法(MSPD)的吸附剂，以乙腈为洗脱剂，HPLC结合荧光检测器对花生中的四种AFr进行测定，回收率为78％。86％，相对标准偏差是4％～7％，检测限范围达0．125～2．5 ng／g。高效液相色谱法是目前国内测定黄曲霉毒素使用最多、也是比较权威的方法，灵敏度高、精度高、能同时分析多种黄曲霉毒素类型，但该法的样品前处理相对复杂，检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多、操作时需要专门的技术人员，难以满足现代检测快速、简捷、现场化的要求。4．3免疫分析法免疫化学分析法(1mmunochemicalMethods)是以抗原抗体的免疫化学反应为基础进行抗原抗体含量测定的方法。该法具有高度的特异性、灵敏性、快速简便、分析费用低、重现性好、短时间内能处理大量样品和易于普及等优点。用于黄曲霉毒素测定的免疫分析法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、流动注射免疫测定法(n一队)等。4．3．1免疫亲和柱(nc)一荧光光度法免疫亲和柱是以单克隆免疫亲和柱为分离手段，根据单克隆抗体与载体蛋白偶联后将其填柱形成IAC，并与黄曲霉毒素抗原产生一一对应的特异性吸附关系制作的。随着抗体抗原一一对应的特异性吸附关系，IAC只能高选择性地吸附黄曲霉毒素而让其他杂质通过的柱子，同时这种吸附又可被极性有机溶剂洗脱，供定量检测，用荧光计、紫外灯作为检测工具【7。。农业部油料及制品质检中心根据GB／T18979---2003研制成NYART2004型黄曲霉毒素速测仪，其系统由黄曲霉毒素B，测定仪主机，仪器专用试剂盒组成。附带仪器专用试剂盒，进口亲和柱(消耗品)。该仪器采用的是免疫亲和层析净化一荧光光度法，黄曲霉毒素B，检出限为0．1>g／kg，测定范围0．1～20 ttg／kg，样品处理和测定20 min／样，黄曲霉毒素Bl测定方法回收率大于90％。黄曲霉毒素B，速测仪内置1000组测定数据存储，可即时打印也可输入计算机，只需根据提示选择即可。测定结果直接显示为黄曲霉毒素B．含量，无须计算。该法的优点：减少样品前处理的操作烦琐、复杂，是一种新的、简便快速的、灵敏度极高的方法，一个样品只需10～15 min，比传统方法快几个小时甚至几天时问r卜8|。该法克服了TLC和HPLC法在操作过程中使用剧毒的APT作为标定标准物和在样品预处理过程中使用多种有毒、异味的有机溶剂，大大减少操作人员健康和环境污染的影响。4．3．2免疫亲和柱一HPLC法将免疫亲和柱与高效液相色谱法结合应用，是目前采用较多的一种方法，黄曲霉毒素免疫亲和柱一高效液相色谱法比传统的HPLC法更加安全、可靠，提高了灵敏度和准确度，达到既定量准确又快速简便的要求。它是采用单克隆抗体免疫技术，可以特效性地将AFr或其他真菌毒素分离出来，分离效率和回收率高。陈建民等旧J以乙腈和水混合作为样品的提取液，通过Aflaochra免疫亲和柱净化提纯，用HPLC结合荧光检测器，分析的时间只需要大约40 min，检测限可达0．2 ng／g。可以避免传统TLC和HPLC的缺点，在短时间内可有效地从大量的食品中分离提取出AFr。4．3．3酶联免疫吸附法(ELISA)ELISA法是应用抗原抗体特异性反应和酶的高效催化作用来测定AFT含量的免疫分析方法，具有特异性高、灵敏度高、快速、简便等优点。ELISA测定方法的基本模式包含3种特定的试剂：①固相抗原(蛋白质结合物包板)；②酶标记单克隆抗体；③酶作用底物。常用的方法有四种：反向直接竞争ELISA、直接竞争ELISA、间接竞争ELISA和生物素一亲和素EuSA。ELISA法将已知的待测AFB，抗原(或抗体)吸附于固定载体的免疫吸附剂上，洗涤未吸附的其他抗原和杂质，加入酶标记的AFB．抗体(或抗原)与样品中的待测物(抗原或抗体)发生特异免疫学反应，形成酶标记的抗原一抗体复合物，洗涤后，加入酶底物，进行显色反应，通过颜色的深浅来测定AFBl抗原或抗体的含量。ELISA法相对于HPLC具有特异性强、干扰小，样品的预处理简便，且快速、灵敏、高效等特点，而且回收率高，提取方法简单，可以进行定性和定量测定，并且对设备装置的投资比HPLC降低了许多，大大节约了测试的成本，因而ELISA已广泛用于食品中黄曲霉毒素的测定。近年来，国内不少科研机构、检验检疫部门对ELISA法研究改良，建立了较多的快速检测方法，如AFB，试剂盒(国内有无锡市生物技术公司的EHSA试剂盒，国外有德国拜发罗恩公司ELISA试剂盒等)、AFBl试纸等旧j。蔡其洪等介绍了一种酶联免疫方法，利用直径为98脚的微球替代传统的酶标板，将一定量已吸附了黄曲霉毒素B，与牛血清白蛋白连接物的免疫微球置于反应容器中，依照竞争ELISA分析方法原理和程序检测AFB，含量，检测限达0．2 ng／mL，全过程仅需要2．5 h110J，由于ELISA法中酶的活性易受反应条件影响，ELISA法测定结果重回

文章来源：粮油食品科技 网址: http://lyspkj.400nongye.com/lunwen/itemid-15156.shtml

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